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重磅!国家药监局发文,干细胞产品和检测相关需重点关注

2023年10月7日,国家药品监督管理局发布《关于公开征求《人源干细胞产品非临床研究技术指导原则(征求意见稿)》意见的通知》,指导原则明确在非临床研究中需要考虑以下因素(包括但不限于):细胞来源、生物学特性、作用机制;生产过程(如体外培养、 纯化、诱导分化、扩增、基因修饰/改造等);终产品中不同分化阶段细胞的数量/比例;终产品中可能残留的非目的细胞(如未分化细胞、非预期分化细胞等)、非细胞成分(如杂质/外源因子等);临床拟用人群、给药方式、预期的药理作用靶部位;细胞在受者体内的迁移、定植、分化及存续能力;细胞的免疫原性和受者对细胞的免疫反应;成瘤性和致瘤性的风险等。对于指导原则中明确的考虑因素,尽早布局相关检测。



分子检测


基因表达分析:通过检测细胞中特定的基因是否被激活或沉默,可以判断细胞的类型和状态。例如,人胚干细胞和诱导多能干细胞通常表达一些多能性基因,如OCT4, SOX2, NANOG等,而人的成体干细胞则不表达或表达很低。基因表达分析的方法有很多,如实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)、微阵列(microarray)、转录组测序(transcriptome sequencing)等。

蛋白质检测:通过检测细胞表面或内部的特定的蛋白质,可以判断细胞的类型和状态。例如,人胚干细胞和诱导多能干细胞通常表达一些多能性标志物,如SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81等,而人的成体干细胞则不表达或表达很低。蛋白质检测的方法有很多,如免疫荧光染色(immunofluorescence staining)、流式细胞术(flow cytometry)、免疫印迹法(immunoblotting)等。

表观遗传分析:通过检测细胞中DNA或组蛋白的甲基化、乙酰化等修饰,可以判断细胞的类型和状态。例如,人胚干细胞和诱导多能干细胞通常具有一种称为双向启动子(bivalent promoter)的表观遗传特征,即同时存在着激活和沉默基因的修饰,使得它们可以在适当的信号下快速分化为不同的细胞类型。而人的成体干细胞则没有这种特征。表观遗传分析的方法有很多,如甲基化敏感性限制酶消化法(methylation-sensitive restriction enzyme digestion)、双链DNA免疫沉淀法(double-stranded DNA immunoprecipitation)、染色质免疫沉淀法(chromatin immunoprecipitation)等。



基本因素检测


细胞来源:细胞来源是指干细胞产品中的细胞是从哪里获取的,例如胚胎、脐带血、骨髓、脂肪等。细胞来源可以通过一些标志物来鉴定,例如表面抗原、转录因子、基因表达等。一些常用的检测方法有流式细胞术、免疫荧光、实时荧光定量PCR等。

生物学特性:生物学特性是指干细胞产品中的细胞具有的一些功能和性能,例如自我更新能力、增殖能力、分化能力、免疫原性等。生物学特性可以通过一些实验来评估,例如集落形成实验、细胞周期分析、分化诱导实验、混合淋巴细胞反应等。

作用机制:作用机制是指干细胞产品在体内发挥治疗作用的原理和途径,例如迁移、定植、分化、分泌因子等。作用机制可以通过一些模型和技术来探究,例如动物模型、荧光标记、基因芯片、蛋白质组学等。



示例:干细胞来源检测产品


  1. 采用一种基于引物探针的荧光报告系统,利用特异性的引物和探针来扩增和检测不同来源的干细胞中的特征性基因或转录因子。例如,胚胎干细胞中的OCT4、NANOG、SOX2等,脐带血干细胞中的CD34、CD133等,骨髓间充质干细胞中的CD44、CD90等。

  2. 使用多重实时荧光定量PCR技术,可以在同一反应管中同时检测多个靶标,并使用不同颜色的荧光染料来区分。这样可以提高检测效率和准确性,同时节省试剂和样品。

  3. 提供一套完整的反应体系和操作流程,包括模板提取、反应混合液配制、PCR反应条件设置、数据分析软件等。用户只需按照说明书操作,即可获得可靠的结果。

  4. 提供一系列的质控品和标准品,用于验证反应体系的性能和建立标准曲线。通过比较未知样品的阈值循环数(CT值)和标准曲线,可以计算出未知样品中干细胞的起始拷贝数和来源。



生产过程检测

基于微流控芯片的干细胞培养和纯化系统,可以实现高效、精确和可控的干细胞培养和分离。利用微流控技术,通过调节培养液的流速、温度、气体等参数,模拟干细胞的生理环境,促进其增殖和分化。同时还可以利用微流控阀门和电泳技术,根据干细胞的大小、形状、电荷等特性,实现干细胞的纯化和收集。

基于核酸适配体的干细胞诱导分化,可以实现高效、简便和特异的干细胞诱导分化。利用核酸适配体技术,通过筛选出能够特异性结合干细胞表面受体的核酸分子,模拟生长因子或细胞因子的作用,激活干细胞的信号通路,诱导其向目标细胞类型分化。目的要求具有低毒性、低免疫原性、低成本等优点。

基于CRISPR/Cas9技术的干细胞基因编辑工具,可以实现高效、精确和灵活的干细胞基因修饰或改造。该工具利用CRISPR/Cas9技术,通过设计能够特异性识别目标基因序列的导向RNA(gRNA),结合Cas9核酸酶,实现对干细胞基因组的切割或插入。该工具可以用于增加或减少干细胞的功能基因,或者引入外源基因,改变干细胞的表型或功能。



终产品检测


基于荧光活细胞成像仪的干细胞分化分析系统,可以实现高通量、高分辨率和动态的干细胞分化过程的监测和定量。该系统利用荧光活细胞成像仪,通过设置不同的波长和滤镜,对干细胞分化过程中表达的特异性荧光蛋白进行连续拍摄和记录。通过对图像进行分析,可以计算出不同分化阶段细胞的数量、比例、形态、迁移等参数。该系统可以用于评估干细胞分化效率、稳定性和一致性。

基于流式细胞术的干细胞分化鉴定,可以实现快速、准确和特异的干细胞分化状态的鉴定。利用流式细胞术,通过使用不同的荧光标记抗体,对干细胞分化过程中表达的特异性表面标志物进行检测和计数。通过对数据进行分析,可以确定干细胞分化为哪些细胞类型,以及各种细胞类型的数量和比例。最终用于评估干细胞分化质量、纯度和多样性。

基于单细胞转录组测序的干细胞分化谱系重建,实现高深度、高灵敏度和高分辨率的干细胞分化过程的解析和重建。利用单细胞转录组测序,通过对干细胞分化过程中每个单个细胞的全基因组表达水平进行测定和比较。通过对数据进行聚类、降维、轨迹推断等方法,揭示干细胞分化过程中的关键基因、信号通路、转录因子等因素,以及各种分化阶段之间的关系和转换。最终用于评估干细胞分化机制、潜能和多样性。



非目的残留检测

干细胞终产品中可能残留的非目的细胞和非细胞成分是影响干细胞产品安全性和有效性的重要因素,需要进行严格的检测和控制。

非目的细胞:非目的细胞是指干细胞产品中不符合预期目标的细胞,例如未分化细胞、非预期分化细胞等。这些细胞可能会导致受者体内发生不良反应,如免疫排斥、炎症、肿瘤等。

细胞表面标志物检测:利用特异性抗体或荧光染料,对干细胞产品中表达的特定细胞表面标志物进行检测,以区分不同类型和状态的细胞。例如,利用CD34、CD133等抗体,检测干细胞产品中是否含有未分化或部分分化的造血干细胞。一些常用的技术有流式细胞术、免疫荧光、酶联免疫吸附试验等。

基因表达检测:利用特异性引物或探针,对干细胞产品中表达的特定基因或转录因子进行检测,以区分不同类型和状态的细胞。例如,利用OCT4、NANOG、SOX2等引物或探针,检测干细胞产品中是否含有未分化或部分分化的多能干细胞。一些常用的技术有实时荧光定量PCR、原位杂交、基因芯片等。

非细胞成分:非细胞成分是指干细胞产品中除了目标细胞以外的其他成分,例如杂质/外源因子等。这些成分可能会影响干细胞产品的质量和稳定性,或者对受者体内造成污染或毒性。

内毒素检测:内毒素是一种由革兰氏阴性菌释放的脂多糖,具有强烈的致炎和致死作用。内毒素可能会污染干细胞产品中使用的培养液、添加剂或器械等。

微生物检测:微生物是指干细胞产品中可能存在的细菌、真菌、病毒等微小生物,可能会导致干细胞产品的污染或受者体内的感染。



免疫性原性


细胞的免疫原性和受者对细胞的免疫反应是影响干细胞产品安全性和有效性的重要因素,需要进行严格的检测和控制。一些常用的检测方法有:

细胞的免疫原性:细胞的免疫原性是指干细胞产品中的细胞是否能够被受者体内的免疫系统识别和攻击,导致免疫排斥或耐受。细胞的免疫原性主要取决于细胞表面表达的主要组织相容性复合物(MHC)分子,以及其他共刺激分子、附属分子等。细胞的免疫原性的检测方法主要有:

MHC分型:利用特异性抗体或探针,对干细胞产品中表达的MHC分子进行检测,以确定其与受者体内MHC分子的相似度或差异度。一些常用的技术有流式细胞术、PCR-SSP、PCR-SSO等。

共刺激分子和附属分子检测:利用特异性抗体或探针,对干细胞产品中表达的共刺激分子和附属分子进行检测,以评估其对受者体内T细胞活化或抑制的影响。一些常用的技术有流式细胞术、实时荧光定量PCR等。

受者对细胞的免疫反应:受者对细胞的免疫反应是指干细胞产品在受者体内引发的免疫应答,包括体液免疫和细胞免疫两种类型。受者对细胞的免疫反应主要取决于干细胞产品与受者体内MHC分子的匹配程度,以及其他因素如给药方式、剂量、频率等。受者对细胞的免疫反应的检测方法主要有:

体液免疫检测:利用特异性抗体或抗原,对受者血清中存在的针对干细胞产品中细胞或其成分的抗体进行检测,以评估其对干细胞产品在体内存活和功能的影响。一些常用的技术有酶联免疫吸附试验、荧光抗体试验等。

细胞免疫检测:利用特异性抗原或抗体,对受者外周血单个核细胞(PBMC)中存在的针对干细胞产品中细胞或其成分的T细胞进行检测,以评估其对干细胞产品在体内存活和功能的影响。一些常用的技术有混合淋巴细胞反应、ELISPOT、流式细胞术等。


成瘤性和致瘤性


成瘤性和致瘤性的风险是指干细胞产品中的细胞是否能够在受者体内形成肿瘤或诱发肿瘤,导致严重的不良后果。成瘤性和致瘤性的风险主要取决于干细胞产品中的细胞类型、分化状态、基因稳定性、免疫相容性等因素。

细胞类型和分化状态检测:利用特异性抗体或探针,对干细胞产品中表达的特定细胞类型或分化状态的标志物进行检测,以评估其是否具有成瘤或致瘤潜能。例如,利用OCT4、NANOG、SOX2等标志物,检测干细胞产品中是否含有未分化或部分分化的多能干细胞,这些细胞具有较高的成瘤性。利用p53、Rb、Bcl-2等标志物,检测干细胞产品中是否含有癌变或易癌变的细胞,这些细胞具有较高的致瘤性。一些常用的技术有流式细胞术、免疫荧光、实时荧光定量PCR等。

基因稳定性检测:利用特异性引物或探针,对干细胞产品中存在的基因突变、缺失、重排等异常进行检测,以评估其是否影响细胞的正常功能或调控,导致成瘤或致瘤。例如,利用TP53、KRAS、EGFR等引物或探针,检测干细胞产品中是否含有与肿瘤相关的基因突变。利用FISH、CGH等技术,检测干细胞产品中是否含有与肿瘤相关的染色体异常。一些常用的技术有实时荧光定量PCR、FISH、CGH等。

免疫相容性检测:利用特异性抗体或抗原,对干细胞产品中表达的主要组织相容性复合物(MHC)分子进行检测,以评估其与受者体内MHC分子的匹配程度,以及其对受者体内免疫系统的影响。例如,利用HLA-A、HLA-B、HLA-C等抗体,检测干细胞产品中是否含有与受者相同或相似的MHC I分子,这些分子可以减少免疫排斥反应,但也可能增加肿瘤逃逸反应。利用HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP等抗体,检测干细胞产品中是否含有与受者不同或不相似的MHC II分子,这些分子可以增加免疫监视反应,但也可能增加免疫攻击反应。一些常用的技术有流式细胞术、PCR-SSP、PCR-SSO等。


2023-10-16
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